با هدف مطالعه بیان پریپلاسمی هورمون رشد انسانی در اشریشیاکلی، cDNA مربوطه در داخل دو پلاسمید بیانی حامل توالی کد کننده پپتید نشانه pelB قرار داده شد. دو پلاسمید که یکی مجهز به پروموتر باکتریایی lac و دیگری مجهز به پروموتر باکتریوفاژی T7 می باشند به ترتیب به داخل سویه های TG1 و BL21(DE3) از اشریشیاکلی منتقل شدند. برای القا این سیستم های بیان کننده، IPTG و انالوگ طبیعی ان، لاکتوز، مورد ازمایش قرار گرفتند. نتایج به دست امده از بررسی بیان پروتئین در این کلون ها نشان دهنده بیان انبوه hGH در سیستم مبتنی بر T7 است که بسیار بیشتر از مقدار بیان شده در سیستم تنظیم شده با پروموتر lac است. در هر دو سیستم مورد ازمایش، بخشی از هورمون رشد تولید شده در سیتوپلاسم باکتری نوترکیب به صورت پیش‑ پروتئین باقی می ماند و بخش دیگر به صورت پروتئین بالغ به فضای پریپلاسمی منتقل می گردد. هرگونه کاهش در سطح بیان منجر به پردازش و انتقال کامل هورمون رشد انسانی به فضای پریپلاسمی باکتری های نوترکیب نگردید. بنابراین پیشنهاد می گردد که برای دستیابی به بیان پریپلاسمی هورمون رشد انسانی به طور کارامد در اشریشیاکلی، یک راهکار تلفیقی در برگیرنده استفاده از پپتید نشانه مناسب، افزایش حلالیت پیشساز پروتئین علاوه بر بهینه سازی شرایط رشد والقا مورد توجه قرار گیرد.

بیان هورمون رشد انسانی تحت کنترل پروموتر باکتریوفاژی T5 در پلاسمید بیان کننده pQE30 مورد مطالعه قرار گرفت. برای بیان کارامد هورمون رشد انسانی تعدادی از کدون های رمز کننده انتهای امینی هورمون رشد انسانی بر اساس کدون های اصلی اشریشیاکلی تغییر داده شد. نتایج به دست امده نشانگر بیان بالای هورمون رشد نوترکیب توسط باکتری های حاوی پلاسمید نوترکیب در دمای °C37 در حضور IPTG است. بیان بالای هورمون رشد انسانی در درجه حرارت °C30 نیز در غیاب IPTG توسط باکتری نوترکیب مشاهده شد. بر این اساس بیان هورمون رشد انسانی تحت القاء به روش کاهش درجه حرارتی از °C37 به °C30 بدون القاء شیمیایی مورد ازمون و تایید قرار گرفت. پلاسمید نوترکیب ساخته شده در این تحقیق در میزبان TG1 دارای پایداری بالا در شرایط غیر انتخابی است. باکتری های نوترکیب حاوی پلاسمید نوترکیب pQE‑hGH پس از رشد در شرایط تخمیر غیرمداوم قادر به تولید 53 میلی گرم هورمون رشد در لیتر محیط کشت هستند. ما از تشکیل Inclusion body برای بازیافت هورمون رشد بهره بردیم. سپس تخلیص هورمون رشد نوترکیب با دیافیلتراسیون و refolding دنبال شد. هورمون رشد تولید شده در این سیستم از نظر زیستی فعال بود به نحوی که توانایی اتصال به گیرنده اختصاصی خود بر سطح سلول های IM9 را دارد.

حفظ سطح غلظت کلسیم خون یک فرایند پویا است که با بر هم کنش چند عضو مانند روده، کلیه و غده های پاراتیرویید صورت می گیرد. هورمون انسانی پاراتیرویید (hPTH) با افزایش جذب روده ای کلسیم و کاهش دفع کلیوی موجب افزایش سطح کلسیم خون می شود. از آنجایی که در صورت ناکافی بودن مقدار کلسیم در خون، به طور معمول این عنصر از استخوان ها برداشته می شود بنابراین کمبود این هورمون باعث پوکی استخوان و بیماری های ناشی از اختلال های غده های پاراتیرویید می شود. در این پژوهش از پلاسمید Puc 57 و سویه Escherichia coli DH5α برای کلون کردن و از پلاسمید Pet 32a (+) و سویه Escherichia coli BL21 برای بیان پروتیین استفاده شدند. در این پژوهش تولیدپروتیین به صورت ناپیوسته در ارلن های یک لیتری و همچنین به صورت ناپیوسته به همراه خوراک دهی در یک فرمانتور 10 لیتری همزن دار بررسی شد. طبق نتیجه های این پژوهش، کشت ناپیوسته در ارلن ها نشان داد که پس از 16 ساعتمقدار زیست توده و پروتیین نو ترکیب به ترتیب به g/L 5/6 و g/L 7/1 می رسد. همچنین در حالت ناپیوسته به همراه خوراک دهی، بیش ترین مقدار زیست توده و پروتیین نو ترکیب درون فرمانتور پس از 12 ساعت به ترتیب به g/L 81 و g/L22 به دست آمد. سرانجام تولید پروتیین نوترکیب با دو آزمایش SDS-PAGE و Western blot مورد تایید قرار گرفت. در این پژوهش وجود باند پروتیینی در ناحیه 37 کیلو دالتون نشان دهنده درستی بیان هورمون پاراتیرویید می باشد. با توجه به تولید موفقیت آمیز هورمون انسانی پاراتیرویید در این پژوهش و همچنین مزیت های باکتری اشریشاکولی به عنوان میزبان، به نظر می رسد این روش می تواند جایگزین مناسبی برای تولید این ماده ارزشمند دارویی باشد.

زمینه و هدف: اینترفرون ها وسیله دفاعی بدن علیه ویروس ها هستند که به سرعت در بدن تولید شده، سلول های اطراف را به تولید پروتئین هایی که تکثیر ویروس را مهار، یا پاسخ ایمنی و رشد سلولی را کنترل می کنند، تحریک می کنند. با توجه به اهمیت دارویی اینترفرون آلفا 2b انسانی در ایران و جهان، تولید این دارو در داخل کشور و از طریق بیوشیمیایی امکان پذیر اما بسیار مشکل می باشد. زیرا تولید این پروتئین توسط سلول های سالم بسیار کم انجام می شود. هدف از این تحقیق، همسانه سازی (Cloning) و بیان ژن اینترفرون آلفا 2b انسانی در باکتری اشرشیاکلی در یک سیستم بیانی مناسب جهت امکان هدایت پروتئین تولید شده به فضای پریپلاسمی باکتری است. بیان در پریپلاسم، فضای عالی برای تشکیل پیوندهای صحیح و پیچش صحیح ایجاد می کند. ناخالصی پروتئین و فعالیت پروتئازها در پریپلاسم کمتر از سیتوپلاسم است و تخریب و تجزیه پروتئین ها در پریپلاسم کمتر اتفاق می افتد.روش بررسی: ژن اینترفرون آلفا 2b پس از تکثیر با آغازگرهای اختصاصی در ناقل بیانی pET-26b(+) تحت کنترل پروموتور T7 و پپتید نشانه پریپلاسمی pelB و با استفاده از آنزیم های برشی NcoI و XhoI کلون گردید و به باکتری اشرشیاکلی سویه BL21 (DE3) منتقل گردید. همسانه سازی ژن اینترفرون آلفا در ناقل بیانی (+) pET-26b با استفاده از Colony PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی، تایید شد. سپس بیان ژن اینترفرون آلفا با استفاده از آنالیز بلات نقطه ای در فضای پریپلاسمی و به صورت پروتئین کل در زمان های مختلف پس از القاء با IPTG مورد بررسی قرار گرفت.یافته ها: با استفاده از آنالیز بلات نقطه ای تایید شد که پروتئین نوترکیب اینترفرون آلفا 2b در سیستم بیانی اشرشیاکلی تولید و وارد فضای پریپلاسمی باکتری شده است.نتیجه گیری: این تحقیق می تواند امکان تولید پروتئین مهم اینترفرون آلفا 2b انسانی نوترکیب را در شکل صحیح خود و با صرف هزینه های بسیار پائین تر فراهم آورد.

مقدمه: پپتید آمیلوئید بتا (Aβ) علت اصلی تشکیل پلاگ های سمی در بیماران آلزایمری می باشد. به همین علت، مطالعه بر روی این پپتید و شناخت مکانیسم های مولکولی و سلولی مرتبط آن، در تشخیص و درمان بیماری ضروری است. پژوهش حاضر یک روش سریع، آسان و ارزان برای تولید و خالص سازی این پپتید ارائه داده که بر اساس بیان ژن Aβدر سیستم باکتریایی است. مواد و روش ها: ژن Aβسنتز و به وکتور بیانی pET26b انتقال یافت. پس از القا با لاکتوز و انکوباسیون 24 ساعته جهت بیان پپتید، رسوب سلولی حاصل به منظور بررسی و تایید وجود پپتید نوترکیب بوسیله SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی گردید. سپس خالص سازی پپتید نوترکیب با روش کروماتوگرافی تمایلی ستون Ni-NTA صورت گرفت. تعیین ویژگی کشندگی سلولی Aβخالص، در غلظت های  µM 25  و  µM 50 با استفاده از آزمون MTT  بر روی لاین سلولی مدل آلزایمر(SH-SY5Y) انجام شد. نتایج: نتایج PCR Colony و تعیین توالی تاییدکننده ورود صحیح قطعه بیان کننده Aβبه داخل وکتور بیانی می باشد. بررسی طول باندها در SDS PAGE و وسترن بلات، نمایانگر بیان موفقیت آمیز پپتید نوترکیب حاوی دنباله هیستیدینی می باشد. در نهایت نتیجه آزمون MTT نشان داد که پپتید خالص شده در غلظت های µM25  و  µM50 به ترتیب دارای کشندگی 30 و 50 درصدی است. بحث: تولید پپتید آمیلوئید بتا در میزبان های باکتریایی بسیار مطلوب به نظر می رسد. همچنین به دست آوردن پپتید Aβخالص به صورت محلول یک مزیت مهم این تحقیق می باشد. با توجه به عملکرد کشندگی پپتید خالص شده، میتوان از آن برای تیمار سلول های مدل و انجام مطالعات پیرامون آلزایمر استفاده نمود.

سابقه و هدف: ویروسهای پاپیلومای انسانی (HPV) به ویژه انواع 16 و 18 مهمترین عامل سرطان دهانه رحم محسوب می شوند که شایعترین آنها، دو نوع 16 و 18 هستند. از بین انواع پروتئین های مرتبط با HPV، پروتئین های کپسیدی L1 و L2 و نیز انکوپروتئین E7 به عنوان آنتی ژن های هدف برای طراحی واکسن مطرح می باشند. در سالهای اخیر، واکسن های نوترکیب پلی پپتیدی چند اپی توپی مورد توجه قرار گرفته اند. هدف از این مطالعه طراحی سازه فیوژنی L1-L2-E7 و ارزیابی بیان آن در سیستم بیانی باکتری است. مواد و روش ها: در این مطالعه، با استفاده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی مختلف، اپی توپ های ایمنوژنیک و حفاظت شده از پروتئین های L1، L2 و E7 ویروسهای پاپیلومای انسانی نوع 16 و 18 انتخاب شدند. پس از سنتز توالی فیوژن طراحی شده L1-L2-E7 در وکتور کلونینگ pUC57، ساب کلون کردن آن در وکتور بیان پروکاریوتی pET24a(+) توسط آنزیمهای محدودالاثر EcoRI/ HindIII انجام شد. بیان پلی پپتید چند اپی توپی نوترکیب در سویه باکتری E. coli Rosetta توسط القاگر IPTG انجام و تایید آن توسط آنالیزهای SDS-PAGE و وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی ضد دنباله هیستیدینی صورت گرفت. بهینه سازی بیان تحت شرایط مختلف جذب (در طول موج 600 نانومتر)، دما و زمان پس از القا و غلظت IPTG انجام شد. یافته ها: ساب کلون کردن سازه ژنی L1-L2-E7 در وکتور pET توسط حضور باند حدود 525 جفت باز روی ژل آگارز بعد از هضم آنزیمی تایید شد. نتیجه بیان پلی پپتیدL1-L2-E7 در باکتری، حضور باند حدود 20 کیلودالتون را روی ژل SDS-PAGE و وسترن بلات آشکار کرد. بهترین شرایط برای بیان پلی پپتید نوترکیب در دمای 37 درجه، جذب حدود 7/0 تا 8/0، غلظت IPTG یک میلی مولار و زمان 16 ساعت پس از القا بود. نتیجه گیری: بیان موفق سازه پلی پپتید چند اپی توپی L1-L2-E7 در سیستم باکتری انجام شد. تخلیص پلی پپتید نوترکیب به عنوان کاندید واکسن در مراحل بعدی صورت خواهد گرفت.

زمینه و هدف: فاکتور VII یکی از عوامل انعقادی مهم در مسیر خارجی انعقاد خون است که می تواند با فعال کردن FX نیاز بیماران هموفیل را به فاکتورهای VIII و IX رفع نماید. بیان نو ترکیب این فاکتور مشکلات موجود در تهیه فاکتور های مذکور از پلاسما (با توجه به میزان اندک آن ها) و همچنین خطر انتقال بیماری های خونی را برطرف می سازد. لذا هدف از این پژوهش بیان فاکتور مذکور به صورت نو ترکیب و در سطح بالا با استفاده از فناوری Gateway و TOPO cloning می باشد.مواد و روش ها: در این تحقیق تجربی، cDNA فاکتور VII از رده سلولی کبدی HepG2 به کمک PCR جدا شد و سپس با تکنیک TOPO Cloning ژن مورد نظر در ساختمان ناقل پروکاریوتی قرارگرفت. ناقل نوترکیب پس از غربالگری برای کلونی های باکتریایی استخراج و از آن برای انجام واکنش نوترکیبی LR با ناقل بیانی باکولوویروس در فناوری Gateway استفاده شد. ویروس نوترکیب به میزبان حشره انتقال و پس از غربالگری های لازم بیان پروتئین بررسی گردید. نتایج آنالیز بیان پروتئین با الایزا به صورت تکرار سه تایی (انحراف معیار ± میانگین) ارایه و تفاوت بین گروه ها با استفاده از آزمون آماری تی استیودنت تحت نرم افزار SPSS مورد مطالعه قرار گرفت.یافته ها: نتایج حاصل از تست PCR برای واکنش های کلونینگ و نو ترکیبی همگی حاکی از کلونینگ ژن فاکتور VII با بازدهی بیش از 90 درصد در ساختار ناقل های مورد استفاده بودند. آنالیز های انجام شده برای بیان پروتئین توسط الایزا، SDS-PAGE و وسترن بلات بیان بالای این فاکتور را (30 mg/mL) تایید نمودند. نتایج حاصل از آنالیز الایزای نمونه های کشت آلوده تفاوت معناداری را با کنترل منفی نشان می دادند (P<0.001) و بیشترین سطح بیان در روز هفتم (1.960±0.076) به دست آمد.نتیجه گیری: یافته های حاصل از آنالیز بیان پروتئین نو ترکیب به کمک سیستم بیانی باکولوویروس نمایانگر تولید آن در مقیاس بسیار وسیع تر نسبت به سیستم های بیانی مشابه یوکاریوتی و پروکاریوتی است.

مقدمه: هورمون رشد، یک رشته پلی پپتید غیرگلیکوزیله ترشحی از سلول های غدد هیپوفیز همه مهره داران است که تنوع وسیعی از فعالیت های زیستی را دارا بوده و با توجه به اهمیت این هورمون و کاربردهای درمانی مهم و متنوع آن در پزشکی، تولید نوترکیب آن می تواند از درجه اهمیت بالایی برخوردار باشد. در دهه های اخیر، مهندسی پروتئین و مهندسی ژنتیک سبب شده است که میزان بالایی از سطح بیان و تولید این پروتئین در میزبان های مختلفی از جمله باکتریاشریشیاکلی حاصل شود و با تکنیک های جدید، خالص سازی و سنجش هورمون تولیدی به آسانی انجام گیرد. بنابراین هدف پژوهش مروری حاضر، بررسی تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب (rhGH) و چالش های پیش رو انجام گرفت. نتیجه گیری: از جمله مشکلاتی که در مسیر بیان و تخلیص هورمون رشد انسانی می توان به تولید اجسام توده ای در بیان پروتئین های نوترکیب در سیتوپلاسم سلول ها، آلودگی های ناشی از پروتئین های میزبان، ریکاوری پایین پروتئین از این توده ها، ترشح کم پروتئین ها به فضای پری پلاسمی، هزینه بالای تولید مخصوصاً در مرحله تخلیص و غیره اشاره کرد. به علت عدم نیاز به گلیکوزیله شدن این هورمون و نیز راندمان بالا و سادگی کار، سیستم های باکتریایی مخصوصاً اشریشیاکلیاقتصادی ترین و موثرترین سیستم ها در بیان پروتیئن های هترولوگ هستند و می توان عنوان کرد که باکتری اشریشیاکلیکارآمدترین میزبان برای تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب است. مرحله خالص سازی هورمون معمولاً پرهزینه ترین مراحل تولید محسوب می شود. از این رو یک طراحی مطلوب به منظور داشتن بالاترین میزان ریکاوری پروتئین هدف همراه با حذف همه آلودگی ها از محصول نهایی و کاهش مراحل تخلیص مورد نیاز است.

مقدمه: التیام آسیب های پوستی ناشی از تروما، جراحی و بیماری های مزمن همچنان به عنوان یک مشکل بالینی قابل توجه باقی است. اخیرا پیدایش هورمون رشد نوترکیب انسانی، تعدیل التیام را امکان پذیر ساخته است. اگرچه شمار فزاینده از مقالات به گزارش اثر مطلوب هورمون رشد بر التیام زخم پرداخته اند، برخی مطالعات چنین تاثیری را نفی کرده اند. در واقع عوارض استفاده سیستمیک از هورمون رشد به درستی شناخته نشده است. این مطالعه تلاشی برای شناخت اثر واقعی تجویز موضعی و سیستمیک و با دوز پایین هورمون رشد نوترکیب انسانی بر التیام زخم های پوستی است.روش ها: تعداد 30 رات ویستار به وزن 250 تا 400 گرم انتخاب شدند. رات ها بیهوش شده و به طور تصادفی در دو گروه مورد (که به سطح زخم آنها هورمون نوترکیب انسانی به طور موضعی مالیده شد) و کنترل (که به زخم آنها سالین هم حجم مالیده شد) تقسیم شدند. 7، 10، 14 و 17 روز پس از عمل رات ها مورد معاینه فیزیکی قرار گرفتند و بستر زخم آنها از لحاظ کمی رتبه بندی شد. اختلاف بین دو گروه مورد تحلیل قرار گرفت. مقادیر P کمتر از 5 درصد معنی دار تلقی شد. نتایج: در گروه مورد هیچگونه واکنش حساسیتی در اطراف زخم دیده نشد. در تمام روزها سرعت التیام زخم در دو گروه به طور معنی داری متفاوت بود (مقدار P در روزهای 7، 10، 14، 17 و 21 به ترتیب معادل 0.005، 0.008، 0.014، 0.025 و 0.046 بود).نتیجه گیری: در این کارآزمایی حیوانی التیام پوستی در دو گروه کنترل و شاهد متفاوت بود. ملاک مقایسه دو گروه را وضعیت بستر زخم در نظر گرفتیم. در روزهای معاینه، اختلاف بین دو گروه معنی دار بود. ما از هورمون نوترکیب انسانی با دوز پایین استفاده نمودیم که باعث بهبود روند التیام گشت. اثرات تجویز دراز مدت هورمون نوترکیب انسانی بر تشکیل جوشگاه زخم در انسان هنوز شناخته نشده و محتاج مطالعات بیشتری است.